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GeoMx?DSP空间全转录组精细解析小鼠纹状体多刺投射神经元（SPN）不同亚型的空间表达特征

对大脑内基因表达特征精准全面的分析，对于理解正常的大脑功能以及开发治疗神经系统疾病的新方法都至关重要。空间转录组方法能够对特定的细胞类型进行高分辨率的原位分析，同时保留其真实的组织背景和精确的空间位置信息。

大脑纹状体中超过90%的细胞是多刺投射神经元（SPNs）。SPNs根据多巴胺受体表达分为两大亚群：表达D1多巴胺受体的dSPN亚群和表达D2多巴胺受体的iSPN亚群。最近的研究表明，这些亚群比我们之前所了解的更为复杂——SPNs的基因表达模式与它们所在的纹状体特定的细分区域密切相关。

为了深入分析理解SPNs，在此项研究中，研究人员结合使用GeoMx?DSP数字空间多组学分析系统和与小鼠全转录组检测方案（MouseWTA），分别对小鼠纹状体中不同的多刺投射神经元（SPNs）亚群进行识别和分析。

实验设计：

样本：6只C57BL/6JxDBA小鼠（3只雌性，3只雄性）；

组织类型：2张10um厚的新鲜冷冻大脑冠状组织切片；

形态学标记：

Drd1RNAScope探针识别标记dSPNs；

Adora2aRNAScope探针识别标记iSPNs；

Syto13标记细胞核。

分别在纹状体的背内侧、背外侧和腹外侧选择感兴趣区域（ROI）。以往的研究发现这三个纹状体的细分区域分别负责行使特定的功能，研究人员利用空间全转录组方法来鉴定这三个不同区域中不同细胞亚群所表现的特异性基因表达特征。在每个ROI内，对Adora2a阳性神经元（iSPNs）和Drd1阳性神经元（dSPNs）分别进行了分析，每种细胞平均检测到到个基因。在dSPNs中，个基因在背内侧纹状体与背外侧纹状体中存在明显差异表达；个基因在背外侧纹状体与腹外侧纹状体中存在差异表达。在iSPNs中，76个基因在背内侧纹状体与背外侧纹状体中差异表达，个基因在背外侧纹状体与腹外侧纹状体中差异表达。

该研究建立了一套成熟的工作流程，能够从健康小鼠的组织空间结构中精准识别并分析SPN不同亚群的空间全转录组数据，并证明了该方法的高精确度和准确性。该研究证明了处于纹状体不同空间位置的SPNs之间存在着功能基因的表达差异，强调了在组织空间背景下进行转录组分析的关键性。这些数据和工作流程可作为正常对照，为今后的神经系统疾病小鼠模型的分析研究提供参考。

纹状体中多刺投射神经元的不同亚群

黑质致密部（SNc）释放出的多巴胺调节纹状体的活动：

直接通路SPNs（dSPNs）促进运动；

间接途径SPNs（iSPNs）抑制运动。

纹状体内三个功能亚区域在接收皮层信号输入和基因表达模式上表现出差异：

背内侧（DM）纹状体接收来自联合皮层的收敛信号，通过响应-结果间的关联主要负责目标导向性的行为；

背外侧（DL）纹状体更多参与了习惯性和技巧性的行为，并接收涉及躯干和下肢的感觉运动信号；

腹外侧（VL）纹状体接收涉及上肢和口腔的感觉运动信号。

GeoMx?技术流程

dSPNs和iSPNs不同细胞亚群的空间全转录组分析

图1：纹状体亚区的dSPNs和iSPNs。显微镜下观察小鼠大脑冠状切片中的纹状体。用Syto83（灰色）观察细胞核；dSPNs由Drd1的荧光原位杂交鉴定（水蓝色）；iSPNs由Adora2a的荧光原位杂交鉴定（紫色）。合并后的组织图像中，白色方框展示了背内侧（DM）、背外侧（DL）和腹外侧（VL）纹状体亚区。比例尺在上图中代表1毫米，在下图中代表微米。

在dSPN和iSPN亚群中均检测到超过个基因，清晰地展示了不同亚群显著富集的基因集

图2.对照组小鼠dSPNs和iSPNs细胞的转录情况。(A）每个样本中检测到的基因数量（n=6，每个小鼠分别检测3个纹状体亚区）。每点代表一只小鼠，水平线代表平均值。(B）火山图描述了在dSPNs和iSPNs中的差异表达基因。在dSPNs中明显富集的基因（Foldchange＞1.25，n=39）用水蓝色的点表示，在iSPNs中明显富集的基因（FoldChange1.25，n=31）用紫色的点表示（BHadjustedpvalue0.1）。(C)dSPNs中最富集的十个基因（水蓝色）和iSPNs中最富集的十个基因（紫色）。

iSPNs和dSPN的转录表达情况会因其所在的纹状体空间位置的不同而表现出差异

图3.纹状体不同组织区域的特异性基因表达。火山图描述了在三个纹状体亚区的dSPNs（顶部，水蓝色）和iSPNs（底部，紫色）分别富集的基因。

图4.SPNs在纹状体不同组织空间位置所表现出的表达模式差异。热图列出了在dSPNs和iSPNs中前65个差异表达的基因。

小结

GeoMx?空间转录组分析可在展示小鼠大脑全局组织结构的基础上，进一步实现在复杂组织中对特定细胞亚群基因表达的精准分析。

纹状体SPNs的基因表达具有细胞亚型特异性（dSPN和iSPN）和空间位置特异性（DM、DL、VL）。

该方法可用于研究运动相关和其他纹状体疾病小鼠模型中SPN群体的基因表达变化。

GeoMx?空间全转录分析鉴定出的显著基因可以进一步使用NanoString的CoSMx?空间分子成像系统在单细胞水平上进行功能探索和解析。